개요: 이 프로토콜은 Western Blot을 이용한 단백질 발현 정량 분석 방법을 기술합니다. 전체 실험은 약 2-3일 소요되며, 단백질 추출부터 검출까지의 전 과정을 포함합니다.

원리: 전기영동으로 분리된 단백질을 막으로 전이시킨 후, 특이적 항체를 이용해 목표 단백질을 검출하는 면역학적 기법입니다.

적용 범위: 세포 배양액, 조직 샘플, 혈청 등 다양한 생물학적 시료에 적용 가능합니다.

10× TBS 버퍼 (1L 기준)

1. 증류수 800 mL를 1L 비커에 준비
2. Tris base 24.2 g (최종 농도 200 mM) 첨가
3. NaCl 80 g (최종 농도 1.37 M) 첨가
4. 자석 교반기로 완전히 용해될 때까지 교반 (약 10분)
5. 1N HCl을 이용해 pH 7.6으로 조정 (약 10-15 mL 소요)
6. 증류수로 최종 부피 1L로 맞춤
7. 0.22 μm 필터로 여과 멸균
8. 실온 보관 (최대 6개월)

주의사항:
• pH 조정 시 pH 미터는 사용 전 표준 버퍼(pH 4.0, 7.0, 10.0)로 보정할 것
• 사용 시 1:10으로 희석하여 1× TBS로 사용
• 침전물이 생기면 폐기하고 새로 제조

Version History

v1.2 (2024-01-15)
• 1차 항체 인큐베이션 온도를 실온에서 4°C overnight로 변경
• 세척 단계에 각 세척 시간(5분) 명시
• Troubleshooting 섹션에 "신호 약함" 문제 추가

v1.1 (2024-01-10)
• 블로킹 용액 제조법 추가
• 원심분리 속도를 rpm에서 × g로 변경
• 안전 주의사항 섹션 추가

v1.0 (2024-01-05)
• 초기 버전 작성

세포 배양 프로토콜

1. 세포를 깨운다
2. 배지를 갈아준다
3. 적당히 자라면 계대배양한다
4. 필요할 때 동결보존한다

HEK293 세포주 배양 및 계대배양 프로토콜
Version 1.0 | 최종 수정: 2024-01-15

1. 세포 해동 (Thawing)
1.1. 37°C 수조에서 동결 바이알을 1-2분간 해동 (얼음 알갱이가 약간 남을 때까지)
1.2. 70% 에탄올로 바이알 외부 소독
1.3. 무균 작업대에서 세포 현탁액 1 mL를 15 mL 원심분리 튜브로 옮김
1.4. 예열된(37°C) 완전 배지(DMEM + 10% FBS + 1% P/S) 9 mL를 천천히 첨가
1.5. 실온, 200 × g에서 5분간 원심분리
1.6. 상층액 제거 후 펠렛을 완전 배지 10 mL에 재현탁
1.7. T-75 플라스크에 옮기고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양

2. 배지 교환 (Media Change)
2.1. 현미경으로 세포 상태 확인 (형태, 밀도, 오염 여부)
2.2. 기존 배지를 흡입 제거
2.3. PBS 10 mL로 1회 세척 (선택사항, 대사산물 제거 시)
2.4. 예열된 완전 배지 15 mL 첨가
2.5. 플라스크를 부드럽게 흔들어 배지 균일 분포
빈도: 2-3일마다 또는 배지 색이 노란색으로 변할 때

3. 계대배양 (Subculture)
3.1. 세포 밀도가 80-90% confluence에 도달했을 때 진행
3.2. 배지 제거 후 PBS 10 mL로 2회 세척
3.3. 0.25% Trypsin-EDTA 3 mL 첨가
3.4. 37°C에서 3-5분간 인큐베이션
3.5. 현미경으로 세포 탈착 확인 (플라스크를 가볍게 두드려 탈착 촉진)
3.6. 완전 배지 7 mL 첨가하여 트립신 중화
3.7. 피펫팅으로 세포 덩어리 분산
3.8. 세포 현탁액을 1:3 ~ 1:6 비율로 희석하여 새 플라스크에 분주
3.9. 완전 배지로 최종 부피 15 mL 맞춤
계대 비율: 1:4 (주 2회 계대 시)

4. 동결보존 (Cryopreservation)
4.1. 70-80% confluence의 건강한 세포 사용
4.2. 위의 3.2-3.7 단계 수행
4.3. 실온, 200 × g에서 5분간 원심분리
4.4. 상층액 제거 후 동결 배지(90% FBS + 10% DMSO)에 재현탁
세포 농도: 1-5 × 10^6 cells/mL
4.5. 1 mL씩 동결 바이알에 분주
4.6. 동결 용기(Mr. Frosty 또는 이소프로판올 용기)에 넣어 -80°C에서 overnight
4.7. 다음 날 액체질소 탱크로 옮겨 장기 보관

재료:
• DMEM, high glucose (Gibco, Cat# 11965092)
• Fetal Bovine Serum (Gibco, Cat# 16000044)
• Penicillin-Streptomycin (Gibco, Cat# 15140122)
• PBS, pH 7.4 (Gibco, Cat# 10010023)
• Trypsin-EDTA, 0.25% (Gibco, Cat# 25200056)
• DMSO, cell culture grade (Sigma, Cat# D2650)

품질 관리:
• 배양 시작 후 24시간 내에 세포 부착 확인
• 계대배양 후 세포 생존율 >95% (Trypan blue 염색)
• 정기적 마이코플라즈마 검사 (월 1회)

Troubleshooting:
• 세포가 잘 떨어지지 않으면: 트립신 처리 시간 1-2분 연장
• 세포 성장이 느리면: FBS 농도를 15%로 증가
• 오염 의심 시: 즉시 폐기하고 새 바이알로 시작

[프로토콜 제목]
Version: [버전 번호] | Date: [날짜] | Author: [작성자]

1. Overview
• Purpose:
• Time required:
• Difficulty:
• Key advantages:

2. Materials
2.1 Reagents
2.2 Equipment
2.3 Consumables

3. Solutions
[각 용액의 제조법]

4. Procedure
[단계별 절차]

5. Expected Results
[예상 결과 및 품질 기준]

6. Troubleshooting
[문제 해결 가이드]

7. References
[참고 문헌]

8. Notes
[추가 정보 및 팁]

Change Log

v2.0 (2024-03-01)
• MAJOR: 원심분리 단계 추가로 순도 향상
• MAJOR: 새로운 버퍼 시스템 도입
• 예상 수율 20% 증가

v1.3 (2024-02-15)
• MINOR: 인큐베이션 온도 37°C → 42°C로 변경
• MINOR: 세척 횟수 3회 → 5회로 증가
• Troubleshooting 섹션 확장

v1.2.1 (2024-02-01)
• PATCH: 시약 카탈로그 번호 업데이트
• PATCH: 오타 수정
• PATCH: 안전 주의사항 추가